“ Digestion par des enzymes de restriction ”

Composition : (pour 4 gels)
100 ml de tampon TBE10x pH = 8,3 à diluer 10 fois pour obtenir 1000 ml de tampon
1,6g d’agarose (pour 4 gels)
25 pasteurettes à gouttes calibrées pour dépôts dans les puits
0,25 ml de bleu de dépôt
0,05g d’ADN de saumon lyophilisé
50 µl d’enzyme de restriction EcoR1
100 µl d’une solution d’ADN du phage Lambda digéré par EcoR1
100 µl d’une solution d’ADN du phage Lambda digéré par HindIII
100 µl d’une solution d’ADN du phage Lambda digéré par EcoR1+HindIII
400 ml d’Azure A (coloration du gel)
10 ml d’eau stérile
Notice technique et pédagogique

CONSERVATION 6 MOIS
Congélateur : Ensemble des solutions d’enzyme et d’ADN
Réfrigérateur : Tampon, colorant, eau stérile

DÉLAIS
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MATÉRIEL NÉCESSAIRE
Cuve à électrophorèse ADN - Générateur 90-110 V, 20 mA

Objectifs cognitifs :
Action des enzymes de restriction sur l’ADN. Réaliser et comprendre une électrophorèse.
Génétique: Etude de séquences d’ADN. Propriétés physiques et chimiques de l’ADN.

Manipulation proposée :
Digestion d’ADN de saumon par des enzymes de restriction.
électrophorèse sur gel d’agarose: Migration et séparation de fragments d’ADN de phage Lambda prédigéré par différents enzymes de restriction (HindIII et EcoR1). Coloration du gel à l’Azure A

Résultats obtenus :
Le gel comprend six puits. Les trois premiers puits correspondent à l’ADN de saumon dilué au 1/2 et au 1/8 puis digéré par EcoR1. L’ADN digéré est coupé en petits fragments qui migrent plus rapidement dans le gel et que l’on retrouve loin des puits de dépôts. L’ADN non digéré est une grosse molécule qui migre peu.
Les trois puits suivants correspondent à l’ADN du bactériophage Lambda (48502 paires de bases) digéré par EcoR1, par HindIII puis par EcoR1+HindIII. L’ADN du phage est de petite taille, les différents fragments obtenus par action des enzymes de restriction peuvent être identifiés sur le gel car ils migrent plus ou moins vite en fonction de leur taille.
Nous vous fournissons la taille des fragments obtenus par digestion.
Exercice possible: attribuer à chaque fragment sa taille respective et construire la carte de restriction du phage.